VisuGait 動物步態(tài)分析系統(tǒng)是通過腳印光亮折射技術，采用高速攝像機采集移動中的大小鼠行走過程中的足印信息，然后利用上海欣軟自主開發(fā)的足印步態(tài)分析系統(tǒng)自動識別分析小鼠的步態(tài)指標，以評價小鼠的運動和空間學習能力。評價指標包括：觸地面積、擺動速度、擺動時長、制動時長、步行周期、前后肢步寬、正常步序比等等，以此客觀評價PD模型的步態(tài)改變。

動物步態(tài)分析系統(tǒng)可用于評價神經(jīng)創(chuàng)傷、神經(jīng)性、神經(jīng)疾病、以及疼痛癥狀群的動物模型。該系統(tǒng)應用范圍包括：脊索損傷、神經(jīng)性疼痛、關節(jié)炎、中風、帕金森病、運動失調、腦損傷、外周神經(jīng)損傷等疾病的研究。通過步態(tài)分析，了解神經(jīng)源性疾病發(fā)展過程、評價治療方法的效果和篩選治療藥物。

帕金森氏癥導致肢體動作僵硬和協(xié)調性降低。步態(tài)分析系統(tǒng)通過測量動物模型中的腳間距離、擺動時相、支撐方式和正常步序比等參數(shù)評估運動協(xié)調性。

摘要

帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）是世界范圍內第二大神經(jīng)退行性疾病，由于目前并未開發(fā)出前期的診斷方法，在病程中后期已無法治，臨床上多采用保守治療，藥物緩解癥狀和手術輔助治療。目前常用左旋多的巴來彌補多巴胺能神經(jīng)元缺失所引起的多巴胺分泌不足，但是這種藥物緩解PD癥狀依賴于多巴脫羧酶的催化而發(fā)揮藥效，隨著晚期PD病人的神經(jīng)元缺失，這種酶也將減少，只能在早期發(fā)揮比較明顯的作用，加大藥量的同時也將產(chǎn)生更加明顯的副作用，除了增加肝腎負擔以外，還會引起不自主運動和精神錯亂等癥狀，因此，繼續(xù)探索PD的發(fā)病機制，尋找更加合適的藥物靶標挽救神經(jīng)元的缺失并探索合適的藥物仍然是探索的方向。

研究背景

帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）是一種神經(jīng)退行性疾?。∟eurodegenerative disease），具有不斷演變的復雜性。是以黑質-紋狀體多巴胺能神經(jīng)元的嚴重缺失以及路易小體和神經(jīng)突觸內含物的積累和擴散為主要病理標志的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。帕金森病被認為是繼阿爾茨海默病之后第二大的神經(jīng)退行性疾病，成為世界上患者增長速度最快的神經(jīng)退行性疾病，自1990年到2015年的25年間，病患人數(shù)增長已一倍，達到600多萬。隨著全球老齡化愈加嚴重，預計到2040年，病患人數(shù)將再增長一倍。PD的發(fā)病機制和病因至今尚未明確， 并沒有任何一種獨立學說能夠闡明其分子致病機制，已經(jīng)證明的分子機制包括氧化應激下活性氧簇（Reactive oxygen species，ROS）的過量產(chǎn)生、α-突觸核蛋白（α-synuclein）沉積、多巴胺（DA）合成減少或線粒體功能障礙等。主要影響運動神經(jīng)系統(tǒng)，臨床癥狀主要包括：1.運動癥狀：靜止性震顫、僵硬、步態(tài)異常等。2.睡眠障礙、認知障礙和抑郁等。

為此，探究 PD 致病機制，闡明神經(jīng)元缺失的分子機理或許是突破現(xiàn)有PD治療策略的重要方向。

實驗方法

實驗材料：

1. A53T轉基因小鼠或基因敲除小鼠（品系均為C57BL/6J）。

2. 10%酒精用于擦拭步態(tài)玻璃板。

注：75%酒精氣味刺激性大，頻繁使用將導致小鼠不愿通過跑道。

3. 衛(wèi)生紙。

4. 空籠盒。

行為學測試步驟包括：

（1）VisuGait 動物步態(tài)分析系統(tǒng)軟件，該軟件從位于t臺跑道下方的攝像機接收信息，并檢測由于對跑道表面施加壓力(例如，通過放置爪子)而從跑道表面反射的光線。

（2）把老鼠放到t臺的一邊。

（3）通過簡單的按鈕點擊，以電子方式啟動系統(tǒng)。

（4）讓動物走到跑道的另一邊。

模型建立與藥物處理：目前PD常用模型有神經(jīng)毒素模型和基因編輯模型，其中神經(jīng)毒素模型應用更加廣泛。本課題兩種模型均有涉及，對PD模型A53T轉基因小鼠或基因敲除小鼠，使用小動物麻醉的機對小鼠按推薦計量使用異氟的烷進行麻醉后固定于腦立體定位儀上，通過顱骨的鉆在小鼠顱骨上鉆孔，將顯微注射針植入鉆孔側大腦紋狀體區(qū)域后，使用 6-OHDA（8 mg/kg）對敲除小鼠紋狀體注射，聯(lián)同使用治療藥物21天。

動物生存環(huán)境：將雌雄小鼠分開飼養(yǎng)每籠4-5只，分籠可避免發(fā)情和交配引起的激素水平改變，影響行為學的測試。室溫控制在22-25℃，12-12小時光暗循環(huán)的安靜環(huán)境中。給予充足的食物和飲用水。

注：實驗動物生存環(huán)境一定要安靜， 驚恐狀態(tài)下的小鼠，行為異常，不能反映真實行為學指標。每組小鼠最好不少于8只，以減少個體間差異，避免實驗偶然性。選擇12-14周齡小鼠，神經(jīng)退行性疾病小鼠隨著年齡增加，神經(jīng)元缺失更加嚴重，年齡太大，在病程后期，小鼠無法直立行走，年齡太小，表型不明顯，觀測不到運動異常指標。

行為學測試前準備：

提前適應環(huán)境：將小鼠提前兩天放入測試環(huán)境空間飼養(yǎng)（最好是將設備放在飼養(yǎng)環(huán)境測試），更換環(huán)境后，小鼠因為空調出風口方向、光線照射位置、環(huán)境氣味等改變，而表現(xiàn)出焦慮情緒，而PD患者本身就存在非運動癥狀，環(huán)境可能影響實驗結果。

設備調試：步態(tài)利用的是腳印光亮折射技術，建議實驗者提前一天在實驗預計進行的同一時間段調試設備。

注：白天和夜晚的采光不同，通道的光線明暗對腳印識別至關重要，最初光調試設備就可能要花費幾個小時。其次是相機參數(shù)設置，在多數(shù)神經(jīng)退行性疾病模型中，需要分時間段進行行為學測試，進入步態(tài)軟件設置標尺需要用A4紙畫一個實體的標尺，在課題進行過程中，最好使用同一標尺，也不要改變軟件中方框的大小，因為軟件是通過等比例計算擺動距離、步長、前后肢間距等長度相關指數(shù)，只有在同一標尺下，不同時間段的指標才有比較的意義。

測試前訓練：步態(tài)分析的測試前訓練是必要的，將實驗鼠放入步態(tài)跑道上，第一次上跑道可將同籠鼠一起放入跑道5-10分鐘，保持安靜環(huán)境下，不進行測試，當老鼠通過通道，它會記住有一個出口可以回到籠子里和同伴待在一起，這將會是老鼠真正通過通道的動機。然后分別將實驗小鼠放入跑道一端，將另一端用擋板封堵，在電腦前等待小鼠進入錄像區(qū)域開始記錄。

注：測試開始時，實驗小鼠并不能很好適應環(huán)境，在驚恐狀態(tài)下不會馬上通過通道，切勿驅趕、恐嚇方式促使小鼠通過跑道，一只老鼠幾乎不會停留在玻璃板上超過20分鐘不動，可能測試兩三百只才回出現(xiàn)一次。在陌生環(huán)境中食物引誘的方法也不可取。在一個新的環(huán)境中，老鼠甚至不愿意嘗試這種方法，因為這可能讓他們覺得會威脅到健康。老鼠是全球成功的物種之一，它們非常聰明，通常會避免嘗試任何新事物，除非是為了獲益而承擔風險。通過限制飼養(yǎng)糧食的量，每次通過通道后，通過獎勵小食物顆粒來刺激動物穿過人行道，也有研究者這樣操作。絕大多數(shù)(>95%)的小鼠在經(jīng)過1-2周的訓練后（動物被要求在每天12克的食物限制下每天跑2次），就能夠迅速地連續(xù)跑過步態(tài)設備的玻璃板。這可能是小鼠天生的探索天性所使然。特別注意介紹步態(tài)相關文獻中都強調了小鼠是在自愿狀態(tài)下通過通道，記錄真實的步態(tài)的。